RESUMO

A terapia com células mononucleares (CM) de medula óssea (MO) é uma alternativa ao cultivo de células-tronco mesenquimais (CTM) em que o maior custo é a obtenção de um doador saudável. Os objetivos desse trabalho foram padronizar o método de isolamento de CM derivadas da MO de cães e caracterizá-las como CTM por citometria de fluxo (CF). A MO de um cão com um ano e três meses de idade foi coletada por punção na crista ilíaca com agulha hipodérmica descartável 40x16 e seringa descartável de 10 mL. Foram coletadas duas amostras de 8,0mL, sendo a primeira em 2,0mL de solução anticoagulante CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrose, adenina) e a segunda em 1,0mL de heparina (5000 UI/mL) diluída em 1,0 mL de PBS. As amostras foram diluídas em 10 mL de meio Eagle modificado por Dubelcco (DMEM, Sigma®). Foram previamente preparados 12 tubos Falcon de 15 mL com 2,0mL de Histopaque 1119 (Sigma®) e 2,0mL de Histopaque 1077 (Sigma®), colocado lentamente sobre o primeiro. Cada amostra de MO foi dividida em seis alíquotas, as quais foram colocadas sobre os Histopaques. Os tubos foram centrifugados por 30 minutos a 950G. Após a centrifugação, os anéis de CM foram retirados com pipeta sorológica e submetidos à dupla lavagem em 5,0 mL de DMEM por centrifugação a 400G por 10 minutos. Após as lavagens, as células foram ressuspendidas em PBS e avaliadas em analisador hematológico Analyzer BC2800 Vet. A quantidade de 1x106 células de cada amostra foi ressuspendida em 200mL de PBS e transportadas refrigeradas para realização da CF. As CM foram ressuspendidas em 20mL de PBS, sendo adicionados os anticorpos Anti Human CD9 (AbDserotec®) e Anti Dog CD44 (AbDserotec®). As células foram incubadas por 40 minutos, ressuspendidas em 400mL de PBS, e submetidas à citometria de fluxo em citômetro FACSCALIBUR (BD®). Os resultados foram submetidos à análise de variâncias (ANOVA). Nas amostras coletadas com heparina o rendimento médio foi de 3,64x104 células mononucleares/mL (±3,17), e nas amostras coletadas com CPDA-1 o rendimento foi de 3,02x104 células mononucleares/mL (±2,32) (p<0,003102). Na citometria de fluxo, a média de células marcadas para CD9 foi de 1,38% (±0,4019%) e 1,16% (±0,1545%) do total de células para amostras coletadas com CPDA-1 e com heparina respectivamente. Para o anticorpo anti-CD44 obteve-se marcação de 43,05% (±4,13%) para CPDA-1 e 43,87% (±2,38%) para heparina. Ambos anticoagulantes podem ser utilizados para isolamento de células mononucleares as quais expressam antígenos para CD44 e CD9, podendo ser aplicadas para terapia celular como as células mesenquimais.

Palavras-chave: Terapia Celular, Células-Tronco Mesenquimais, Citometria de Fluxo