RESUMO

A lagarta Lonomia obliqua, conhecida popularmente por taturana, é responsável por um número elevado de acidentes na Região Sul do Brasil. Erucismo lonômico é o quadro clínico decorrente ao acidente com essas lagartas, o qual varia de reações cutâneas leves a reações sistêmicas graves, que incluem distúrbios hemostáticos, hemorragia intracerebral e insuficiência renal aguda. O veneno dessa lagarta é composto por diversas toxinas e, dentre elas, uma fosfolipase A2 (PLA2). O objetivo do presente estudo é obter esta enzima recombinante através da clonagem e expressão heteróloga e avaliar sua atividade bioquímica e biológica. A obtenção da sequência codificante completa da PLA2 se deu por meio da reação em cadeia da polimerase acoplada à transcriptase reversa (RT-PCR), a partir do RNA total extraído das cerdas que produzem e armazenam o veneno da lagarta. Para tal, foram desenhados oligonucleotídeos gene-específicos baseados na sequência de uma PLA2 putativa de L. obliqua depositada no GenBank (AY829845.1). O produto desta reação foi analisado em gel de agarose, extraído e purificado para a ligação em vetor de clonagem pGEM-T. Esta construção foi transformada em cepa E. coli DH5? e, por PCR de colônia, os clones positivos foram selecionados para minipreparação de plasmídeos e posterior sequenciamento da construção. A sequência codificante da PLA2 foi subclonada em vetor de expressão pSMT3, que fusiona uma tag de solubilidade, e esta construção foi transformada em cepa BL21 STAR (DE3) One Shot. Realizaram-se testes de mini expressão a fim de determinar a concentração ideal do indutor IPTG, que permitisse um melhor rendimento proteico. A expressão em larga escala foi realizada segundo o melhor resultado obtido na mini expressão: 0,5mM de IPTG, por 4 horas a 30ºC. Após centrifugação da cultura, as bactérias foram lisadas e centrifugadas novamente para coleta da fração solúvel, a qual foi analisada por SDS-PAGE e Western Blotting. O presente estudo permitiu a obtenção da sequência completa codificante para a PLA2 de L. obliqua e a clonagem e expressão desta toxina, pela primeira vez, em cepa de E. coli. Entretanto, o resultado da expressão revelou uma baixa concentração da PLA2 recombinante solúvel, a maioria sob a forma de corpos de inclusão. Portanto, no presente momento, buscamos novas estratégias, que possibilitem a expressão da forma recombinante da PLA2 de L. obliqua solúvel, ativa e em quantidades ideais para avaliação de suas possíveis atividades biológicas e consequente prospecção de suas aplicações biotecnológicas.

Palavras-chave: Fosfolipase A2, Lonomia Obliqua, Clonagem