RESUMO

A metagenômica permitiu a descoberta de uma grande diversidade de enzimas com características interessantes para o campo da Biotecnologia como esteroseletividade, enantioseletividade, atividade em solventes orgânicos e a altas temperaturas. As lipases catalisam a hidrólise de acilgliceróis de cadeia longa formando ácidos graxos livres e glicerol. Seu mecanismo catalítico é baseado na presença da tríade catalítica, composta por serina, histidina, aspartato/glutamato. As lipases configuram oito famílias, sendo elas classificadas de acordo com sua sequência e propriedades bioquímicas. A partir da triagem feita em uma biblioteca metagenômica, construída a partir do DNA purificado de amostras de solo da Floresta Atlântica Paranaense, foi identificada uma nova família de lipases denominada LipAP (Activate by Proteolysis), cuja principal característica é a dependência de uma protease (PepAP) para a sua ativação. Entretanto, a relação molecular entre a lipase e a protease e as características bioquímicas dessa nova família de lipases não foram determinadas, sendo esse o objetivo desse trabalho. Para tanto, as duas proteínas foram superexpressas a partir do vetor pET28a, purificadas e utilizadas em ensaios in vitro para determinação da relação lipase/protease. Os plasmídeos contendo os genes lipAP e pepAP clonados no vetor pET28a foram transformados na estirpe Rosetta de Escherichia coli para ensaios de superexpressão. A análise dos géis indicou que as proteínas estavam sendo expressas corretamente com os tamanhos esperados. A superexpressão da peptidase PepAP resultou em um produto insolúvel. Diferentes tampões e condições foram testadas para otimizar a produção de PepAP na forma solúvel. As condições que produziram a maior quantidade de proteína solúvel foram utilizadas para expressão em grande quantidade e posterior purificação da proteína. Entretanto, após a etapa de purificação, verificou-se que a maior concentração de PepAP continuou na fração insolúvel. Testes de atividade realizados com a fração solúvel coletada de PepAP e LipAP previamente purificada foram negativos, sugerindo que PepAP, de fato, não se encontrava na fração solúvel. Novos testes estão sendo realizados utilizando tampão contendo uréia para purificar PepAP a partir da fração insolúvel. Em seguida, a lipase ativada será caracterizada bioquimicamente em relação à temperatura e ph ótimos, estabilidade em diferentes temperaturas e ph, e atividade em metais e detergentes.

Palavras-chave: Bioprospecção, Metagenômica, Lipase